Tak1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m2): sc-424044-LAC-2

Il gene murino Map3k7 codifica TAK1 (TGF-β–activated kinase 1), una MAP3K che integra segnali provenienti dai recettori TGF-β/BMP, dai membri della superfamiglia dei recettori del TNF, dai recettori Toll-like e dai complessi del recettore per l’IL-1 per attivare a valle le cascate di NF-κB e delle MAPK (JNK, p38 ed ERK). Attraverso la fosforilazione delle MAP2K e del complesso IKK tramite adattatori TAB, TAK1 regola la segnalazione infiammatoria e dell’immunità innata, le risposte allo stress, le decisioni apoptosi/sopravvivenza e l’omeostasi tissutale in molteplici tipi cellulari. Una segnalazione di TAK1 deregolata è associata a una produzione anomala di citochine, a una ridotta integrità delle barriere e a rimodellamento patologico in modelli di malattia infiammatoria, autoimmunità e reti di segnalazione associate al cancro. L’editing genetico mirato di Map3k7 consente la dissezione meccanicistica della segnalazione prossimale ai recettori, del crosstalk tra vie e di fenotipi specifici di tipo cellulare mediante knockout/knockin, epitope tagging o perturbazioni del dominio chinasi in cellule murine e in sistemi in vivo.

Le particelle di attivazione lentivirale Tak1 (m2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Map3k7 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Tak1 (m2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Map3k7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Tak1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Map3k7 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.