TAF I p63 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404427-ACT

TAF1B codifica TAF I p63, un componente centrale del complesso SL1 necessario per l’avvio della trascrizione da parte dell’RNA polimerasi I ai promotori del DNA ribosomiale. Sostenendo la sintesi del pre-rRNA e la biogenesi dei ribosomi, TAF I p63 contribuisce alla funzione nucleolare, al controllo della crescita cellulare e al coordinamento della proteostasi con le esigenze metaboliche. La regolazione della trascrizione dell’rDNA dipendente da TAF1B interseca vie sensibili allo stress che modulano l’integrità del nucleolo e la progressione del ciclo cellulare. Un’alterata regolazione della trascrizione da parte della Pol I e della biogenesi dei ribosomi è stata collegata a stati proliferativi e a fenotipi associati alle ribosomopatie, rendendo TAF1B un bersaglio utile per studi meccanicistici sulla biologia del nucleolo e sul controllo trascrizionale.

TAF I p63 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TAF1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TAF I p63 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TAF1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TAF1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TAF I p63. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TAF1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TAF I p63 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TAF I p63 nelle cellule tumorali con espressione di TAF1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.