T2R38 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402279-ACT

O TAS2R38 codifica o recetor do sabor amargo T2R38, um GPCR que deteta ligandos contendo tioureia e sinaliza através de vias gustativas canónicas que envolvem a ativação, mediada por proteína G, da fosfolipase Cβ2, a mobilização intracelular de Ca²⁺ e a despolarização a jusante dependente de TRPM5. Para além da perceção do sabor na cavidade oral, o T2R38 é expresso em epitélios extraorais, onde pode influenciar a sinalização quimiossensorial e programas celulares associados à defesa inata. Polimorfismos comuns na região codificante alteram a responsividade do recetor e têm sido amplamente utilizados para estudar diferenças interindividuais na perceção do amargo e na biologia quimiossensorial. Estas características tornam o TAS2R38 um modelo útil para investigar a dinâmica de sinalização de GPCR, vias de deteção epitelial e relações genótipo–fenótipo.

T2R38 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TAS2R38 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

T2R38 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TAS2R38 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TAS2R38, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de T2R38. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TAS2R38 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de T2R38 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via T2R38 em células tumorais com expressão de TAS2R38 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.