Swiprosin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404763-ACT

EFHD2 codifica Swiprosin-1, una proteina adattatrice legante il calcio coinvolta nel rimodellamento dinamico del citoscheletro di actina e nel coordinamento della trasduzione del segnale a livello della membrana plasmatica. Swiprosin-1 è stata associata a processi quali l’espansione cellulare, l’adesione e la motilità, in linea con ruoli nella segnalazione calcio-dipendente e nell’organizzazione del citoscheletro. In contesti immunitari e neuronali, la regolazione degli stati di attivazione cellulare associata a EFHD2 è stata studiata in relazione alla segnalazione infiammatoria e alla funzione sinaptica o assonale. Alterazioni dei pattern di espressione di EFHD2 sono state riportate in molteplici contesti rilevanti per la malattia, a supporto della sua utilità come nodo molecolare per analizzare le vie che collegano i flussi di calcio alle risposte citoscheletriche e trascrizionali.

Swiprosin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFHD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Swiprosin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFHD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFHD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Swiprosin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFHD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Swiprosin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Swiprosin-1 nelle cellule tumorali con espressione di EFHD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.