Plasmide CRISPR d'Activation (h) Strumpellin: sc-402808-ACT

WASHC5 code la strumpelline, une sous-unité essentielle du complexe WASH, qui régule la nucléation de l’actine dépendante d’Arp2/3 sur les endosomes afin de contrôler le remodelage membranaire, la tubulation endosomale et le tri des récepteurs et de leur cargaison. Par son rôle dans le recyclage des endosomes vers la membrane plasmique et le trafic associé au rétromère, la strumpelline influence la disponibilité des récepteurs de signalisation, l’organisation du cytosquelette et la motilité cellulaire. La perturbation de la dynamique endosomale dépendante de WASHC5 a été associée à des phénotypes neurodégénératifs, notamment la paraplégie spastique héréditaire, soulignant sa pertinence pour le maintien neuronal et l’intégrité axonale. La fonction de la strumpelline présente donc un intérêt pour l’étude de l’homéostasie endolysosomale, de la dynamique membranaire entraînée par l’actine et de la régulation des voies de signalisation dépendante du trafic intracellulaire.

Strumpellin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WASHC5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Strumpellin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WASHC5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WASHC5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Strumpellin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WASHC5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Strumpellin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Strumpellin dans les cellules tumorales présentant une expression de WASHC5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.