SQSTM1/p62 CRISPR Activationプラスミド (m): sc-422075-ACT

マウスSqstm1は、ユビキチン化されたカーゴとLC3に結合して、アグリファジーやマイトファジーを含む選択的オートファジーを協調的に制御する多機能アダプタータンパク質SQSTM1/p62をコードしており、同時にストレス応答シグナル伝達の統合にも関与する。SQSTM1/p62はKEAP1との相互作用を介してNRF2依存的な抗酸化関連遺伝子の転写を調節し、さらにNF-κBやmTORC1など、栄養感知を炎症やプロテオスタシスへと結び付ける経路の足場（スキャフォールド）として機能する。SQSTM1/p62の量やフラックス（動態）の変化は、オートファジーによる分解回転の指標としてしばしば用いられ、神経変性、代謝異常、がん生物学におけるタンパク質凝集、酸化ストレス、免疫シグナルに関する研究と密接に関連する。マウスモデルでは、Sqstm1の攪乱により、オートファジーとユビキチンシグナルが組織恒常性およびストレス適応をどのように形作るかを解析できる。

SQSTM1/p62 CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Sqstm1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

SQSTM1/p62 CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Sqstm1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はSqstm1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性SQSTM1/p62の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のSqstm1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるSQSTM1/p62依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびSqstm1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるSQSTM1/p62経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。