Spo11 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404432-ACT

SPO11 umano codifica Spo11, un’endonucleasi simile alle topoisomerasi specifica della meiosi che catalizza rotture programmate a doppio filamento del DNA per avviare la ricombinazione omologa. Creando rotture negli hotspot di ricombinazione meiotica, Spo11 promuove la sinapsi, la formazione di crossing-over e la corretta segregazione dei cromosomi durante la gametogenesi, collegandosi così alle vie che regolano la riparazione del DNA, la ricombinazione e la stabilità del genoma. L’alterazione o la disregolazione dell’attività di SPO11 può perturbare la progressione meiotica e gli esiti della ricombinazione, rendendolo rilevante per studi su infertilità, aneuploidia e sui meccanismi che salvaguardano l’integrità cromosomica. SPO11 è anche utilizzato come fattore modello per analizzare la formazione controllata di rotture del DNA e la scelta della via di riparazione in stati cellulari specializzati.

Spo11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPO11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Spo11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPO11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPO11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Spo11. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPO11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Spo11 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Spo11 nelle cellule tumorali con espressione di SPO11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.