SPNS2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405481-ACT

SPNS2 (homólogo 2 de spinster) codifica um transportador de membrana multipasso que regula a disponibilidade extracelular de esfingosina-1-fosfato (S1P), moldando gradientes de S1P que coordenam a migração celular, a homeostase vascular e linfática e o tráfego de células imunes. Ao controlar a exportação de S1P, a SPNS2 influencia a sinalização de receptores de S1P mediada por GPCR e vias a jusante, incluindo PI3K/AKT, MAPK e circuitos de GTPases da família Rho envolvidos na função de barreira e na remodelação do citoesqueleto. A alteração da atividade de SPNS2 tem sido associada a respostas inflamatórias desreguladas e a fenótipos endoteliais/linfáticos em sistemas experimentais, tornando-a relevante para estudos de regulação imune e biologia vascular. Como um nó no metabolismo e na sinalização de esfingolipídios, a SPNS2 é frequentemente investigada pelo seu impacto em sinais do microambiente tecidual e na comunicação intercelular.

SPNS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPNS2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPNS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPNS2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPNS2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPNS2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPNS2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPNS2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPNS2 em células tumorais com expressão de SPNS2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.