SPEC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410599-ACT

O gene humano CDC42SE1 codifica a SPEC1 (proteína efetora pequena 1 de CDC42), um efetor que interage com Cdc42 e ajuda a acoplar a sinalização de GTPases da família Rho à remodelação do citoesqueleto e à polaridade celular. Por meio da modulação da dinâmica da actina e da organização das junções, a SPEC1 pode influenciar processos como migração direcional, formação de protrusões de membrana e arquitetura epitelial. Esse eixo de sinalização se cruza com vias que regulam adesão e motilidade, incluindo redes controladas por GTPases da família Rho que moldam a morfologia celular e a organização dos tecidos. A desregulação de programas efetores de Cdc42, incluindo alterações na expressão de CDC42SE1, é frequentemente investigada em contextos de fenótipos de migração e invasão aberrantes relevantes para a biologia do câncer e outros distúrbios da integridade epitelial.

SPEC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDC42SE1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPEC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDC42SE1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDC42SE1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPEC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDC42SE1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPEC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPEC1 em células tumorais com expressão de CDC42SE1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.