Smurf1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401196-ACT

SMURF1 codifica a Smurf1, uma ligase E3 de ubiquitina com domínio HECT que regula a renovação/degradação de proteínas em redes de sinalização-chave, incluindo as vias TGF-β/BMP-SMAD, WNT/polaridade celular planar e a remodelação do citoesqueleto via sinalização de RhoA. Ao catalisar a ubiquitinação de componentes dessas vias, a Smurf1 influencia a transição epitélio–mesênquima, a migração celular e a diferenciação osteogênica. Alterações na atividade de SMURF1 têm sido associadas à desregulação da sinalização por fatores de crescimento e a processos anômalos de remodelação tecidual implicados na biologia do câncer, na fibrose e na homeostase esquelética. Essas funções tornam o SMURF1 um alvo útil para estudos mecanísticos de proteostase mediada por ubiquitina e de crosstalk entre vias de sinalização.

Smurf1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMURF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Smurf1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMURF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMURF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Smurf1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMURF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Smurf1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Smurf1 em células tumorais com expressão de SMURF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.