Skp2 p45 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400534-ACT

SKP2 codifica la proteina F-box Skp2 p45, una componente di riconoscimento del substrato del complesso ligasi E3 dell’ubiquitina SCF (SKP1–CUL1–F-box), che controlla il turnover proteasomiale di regolatori chiave del ciclo cellulare. Promuovendo l’ubiquitinazione di bersagli come CDKN1B/p27^Kip1 e altre proteine inibitorie della crescita, Skp2 sostiene la transizione G1/S, la competenza alla replicazione del DNA e risposte coordinate ai checkpoint. L’attività di SKP2 interagisce con programmi di segnalazione collegati a PI3K–AKT, RB–E2F e TGF-β, che modellano proliferazione, senescenza e adattamento allo stress. Un’espressione o una funzione deregolata di SKP2 è stata associata ad alterazioni del controllo del ciclo cellulare e a instabilità genomica in molteplici contesti rilevanti per la malattia, rendendolo un nodo comune per studi meccanicistici sulla segnalazione oncogenica e sull’omeostasi proteica.

Skp2 p45 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SKP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Skp2 p45 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SKP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SKP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Skp2 p45. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SKP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Skp2 p45 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Skp2 p45 nelle cellule tumorali con espressione di SKP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.