SKI-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402595-ACT

MBTPS1 codifica SKI-1/S1P, una proprotein convertasi di tipo subtilisina residente nel Golgi che cliva fattori di trascrizione ancorati alla membrana per controllarne l’attivazione e la traslocazione nel nucleo. SKI-1 è un importante regolatore a monte dell’omeostasi di steroli e lipidi tramite la processazione degli SREBP, influenzando così i programmi biosintetici del colesterolo e degli acidi grassi e reti più ampie di segnalazione metabolica. Partecipa inoltre a vie adattative allo stress ER–Golgi modulando l’attivazione di ATF6 e risposte correlate di proteostasi. La disregolazione dell’attività di MBTPS1/SKI-1 è stata associata a fenotipi ereditari del tessuto connettivo e scheletrici e a stati cellulari caratterizzati da metabolismo lipidico alterato, rendendolo rilevante per studi meccanicistici su metabolismo, biologia della via secretoria e segnalazione dello stress.

SKI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MBTPS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SKI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MBTPS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MBTPS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SKI-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MBTPS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SKI-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SKI-1 nelle cellule tumorali con espressione di MBTPS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.