SERCA2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400417-ACT

ATP2A2 kodiert die humane SERCA2‑Ca²⁺‑ATPase des Sarko-/endoplasmatischen Retikulums, eine P‑Typ‑ATPase, die zytosolisches Ca²⁺ in das Lumen von ER/SR pumpt, um die Calciumhomöostase aufrechtzuerhalten und intrazelluläre Speicher wieder aufzufüllen. Durch die Formung von Ca²⁺‑Transienten beeinflusst SERCA2 die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung, die Proteinfaltungskapazität im ER sowie calciumabhängige Signalnetzwerke, die mit Stressantworten und Apoptose verknüpft sind. Die SERCA2‑Aktivität ist in eine phospholambanvermittelte Regulation und umfassendere Ionentransportwege eingebettet, die die zelluläre Bioenergetik und Kontraktilität steuern. Eine Dysregulation oder Mutation von ATP2A2 ist mit einer veränderten ER‑Ca²⁺‑Handhabung assoziiert und wurde mit Störungen der epithelialen Integrität und der Herzphysiologie in Verbindung gebracht, wodurch sich ein mechanistischer Ansatzpunkt zur Untersuchung calciumabhängiger Krankheitsphänotypen ergibt.

SERCA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP2A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SERCA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP2A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP2A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SERCA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP2A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SERCA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SERCA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP2A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.