Rock-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400367-ACT

O gene humano ROCK1 codifica a quinase de serina/treonina Rock-1, um dos principais efetores a jusante de RhoA, que regula a contratilidade actomiosina, a formação de fibras de estresse, a dinâmica das adesões focais e a remodelação das junções célula–célula. A sinalização de Rock-1 integra-se a vias do citoesqueleto e de mecanotransdução para controlar a forma celular, a adesão, a migração e a citocinese, e pode influenciar a apoptose e programas transcricionais por meio da fosforilação de substratos como MYPT1 e as quinases LIM. A atividade desregulada de ROCK1 tem sido associada a alterações na rigidez tecidual e a fenótipos invasivos na biologia do câncer, bem como à disfunção do músculo liso vascular e à remodelação inflamatória relevante para mecanismos de doenças cardiovasculares e fibróticas. Essas propriedades fazem de ROCK1 um alvo amplamente utilizado para dissecar a regulação do citoesqueleto e a comunicação cruzada de sinalização impulsionadas por Rho/ROCK em modelos celulares humanos.

Rock-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ROCK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rock-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ROCK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ROCK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rock-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ROCK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rock-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rock-1 em células tumorais com expressão de ROCK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.