Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNF185: sc-416413-ACT

RNF185 code une ligase E3 de l’ubiquitine à doigt RING, principalement associée au réticulum endoplasmique et aux membranes associées aux mitochondries, où elle contribue à la régulation du contrôle qualité des protéines et de l’homéostasie des organites. En catalysant l’ubiquitination de substrats spécifiques, RNF185 influence des voies de protéostasie, notamment la dégradation associée au RE (ERAD) et la signalisation adaptative au stress, avec des effets en aval sur la dynamique mitochondriale. Des rôles rapportés dans l’autophagie sélective et la régulation de l’immunité innée relient RNF185 à des mécanismes coordonnant les réponses cellulaires aux protéines et organites endommagés. Une signalisation ubiquitine dérégulée et une protéostasie altérée sont des caractéristiques récurrentes dans les maladies neurodégénératives, les troubles métaboliques et la biologie du cancer, ce qui fait de RNF185 un nœud utile pour des recherches axées sur les voies.

RNF185 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNF185 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNF185 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNF185 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNF185, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNF185. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNF185 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNF185 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNF185 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNF185 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.