RMDN3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408451-ACT

RMDN3 (auch bekannt als PTPIP51) ist ein mitochondrienassoziiertes Protein, das die Kommunikation zwischen Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum koordiniert und dadurch die Anheftung der Organellen sowie den Kalziumtransfer beeinflusst. Über diese Kontaktstellen trägt RMDN3 zur Regulation der mitochondrialen Dynamik, der Bioenergetik und stressresponsiver Signalwege bei, die das Zellüberleben und die Homöostase prägen. Eine veränderte RMDN3-Expression oder -Funktion wurde mit einer gestörten Kalziumhomöostase und mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung gebracht – Prozesse, die an neurodegenerativen Phänotypen und an der krebsassoziierten metabolischen Umprogrammierung beteiligt sind. Daher wird RMDN3 in Modellen für mitochondrialen Stress, ER–Mitochondrien-Kopplung und zelluläre Anpassung an proteostatische oder oxidative Belastungen untersucht.

RMDN3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RMDN3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RMDN3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RMDN3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RMDN3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RMDN3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RMDN3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RMDN3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RMDN3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RMDN3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.