RIP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400377-ACT

Das humane RIPK1 (RIP) kodiert eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentraler Regulator der Signalübertragung von TNF-Rezeptoren und Pattern-Recognition-Rezeptoren fungiert und Signale integriert, die über inflammatorische Transkription, Apoptose oder Nekroptose entscheiden. Über Gerüst- (Scaffolding-) und katalytische Funktionen koordiniert RIPK1 die Assemblierung rezeptornaher Komplexe und greift in die NF-κB- und MAPK-Signalwege ein sowie in die durch RIPK3–MLKL vermittelte nekroptotische Ausführung. Seine Aktivität beeinflusst die Zytokinproduktion, zelluläre Stressantworten und die Homöostase der angeborenen Immunität, weshalb es häufig als Knotenpunkt bei Entzündung und Immundysregulation untersucht wird. Eine dysregulierte RIPK1-Signalgebung wurde in Kontexten wie chronisch-entzündlichen Erkrankungen, Neuroinflammation und tumorassoziierter Signalgebung in Verbindung gebracht, was mechanistische Studien zu Zelltod- und Entzündungswegen stützt.

RIP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RIPK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RIP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RIPK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RIPK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RIP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RIPK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RIP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RIP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RIPK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.