RELA/NFκB p65 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422642-ACT

Rela codifica la subunità RELA/NFκB p65, un regolatore trascrizionale centrale della segnalazione canonica di NF-κB, che controlla programmi genici inducibili coinvolti in infiammazione, immunità innata e adattativa, sopravvivenza cellulare e risposte allo stress. Nelle cellule di topo, p65 forma dimeri funzionali comunemente con NFKB1/p50 e trasloca nel nucleo in seguito alla degradazione, mediata da IKK, degli inibitori IκB, integrando segnali provenienti da TNF, IL-1, TLR, recettori dell’antigene e vie di risposta al danno del DNA. La trascrizione dipendente da RELA modula citochine, chemochine, molecole di adesione e fattori anti-apoptotici, plasmando l’attivazione dei macrofagi, la funzione dei linfociti e l’omeostasi tissutale. Un’attività NF-κB/RELA deregolata è associata a stati infiammatori cronici, autoimmunità e reti di segnalazione oncogeniche, rendendo Rela un bersaglio frequente per studi meccanicistici sulla regolazione immunitaria e sulla trascrizione adattativa allo stress.

RELA/NFκB p65 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rela senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RELA/NFκB p65 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rela nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rela, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RELA/NFκB p65. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rela nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RELA/NFκB p65 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RELA/NFκB p65 nelle cellule tumorali con espressione di Rela silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.