Plasmide CRISPR d'Activation (h) RecQL4: sc-403224-ACT

RECQL4 code pour l’hélicase humaine de l’ADN de la famille RecQ, RecQL4, un facteur de maintien du génome indispensable à l’initiation de la réplication de l’ADN, à la stabilisation des fourches de réplication bloquées et à plusieurs mécanismes de réparation de l’ADN, notamment la recombinaison homologue et la réparation par excision de base. RecQL4 agit au sein du réseau plus large de réponse aux dommages de l’ADN afin de préserver l’intégrité chromosomique pendant la phase S et après un stress génotoxique. Une activité dérégulée de RECQL4 est associée au stress réplicatif, à l’instabilité chromosomique et à une sensibilité modifiée aux agents génotoxiques, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des voies de stabilité du génome. Des variants pathogènes de RECQL4 sont associés à des maladies héréditaires caractérisées par des anomalies du développement et une prédisposition au cancer, ce qui étaye son utilisation dans des modèles mécanistiques de dysfonctionnements de réparation de l’ADN liés à la maladie.

RecQL4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RECQL4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RecQL4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RECQL4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RECQL4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RecQL4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RECQL4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RecQL4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RecQL4 dans les cellules tumorales présentant une expression de RECQL4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.