RAMP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401396-ACT

A proteína modificadora da atividade do receptor 1 (RAMP1) é uma subunidade acessória de membrana de passagem única que controla o tráfego, a especificidade por ligantes e a saída de sinalização de complexos de GPCR de classe B, sobretudo ao se associar ao receptor semelhante ao do calcitonina (CALCRL) para formar o receptor canônico de CGRP. Ao moldar a maturação do receptor e sua localização na superfície celular, a RAMP1 influencia a sinalização cAMP/PKA induzida por CGRP e programas transcricionais a jusante que regulam o tônus neurovascular e respostas inflamatórias a neuropeptídeos. A sinalização dependente de RAMP1 tem sido amplamente implicada em mecanismos subjacentes à biologia da enxaqueca e a processos neurovasculares e relacionados à dor de forma mais ampla, além de ser estudada na regulação cardiovascular e na fisiologia das vias aéreas. Como resultado, a modulação da expressão de RAMP1 é útil para dissecar a função de proteínas acessórias de GPCR, a farmacologia de receptores e o viés de sinalização específico do contexto em modelos celulares humanos relevantes.

RAMP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAMP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RAMP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAMP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAMP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RAMP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAMP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RAMP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RAMP1 em células tumorais com expressão de RAMP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.