Rak Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405590-ACT

O FRK humano codifica a Rak, uma tirosina quinase não receptora da família BRK que modula a sinalização intracelular ao fosforilar substratos envolvidos em respostas a fatores de crescimento, adesão e organização do citoesqueleto. A Rak tem sido implicada na regulação da diferenciação epitelial e do controle do ciclo celular por meio de vias que se cruzam com a sinalização por receptores tirosina quinase e com componentes a jusante das redes MAPK/ERK e PI3K/AKT. Alterações na expressão de FRK ou no equilíbrio de sua sinalização têm sido associadas a mudanças em proliferação, migração e respostas ao estresse observadas em múltiplos contextos relevantes para doenças, incluindo a biologia do câncer. Como um nó em circuitos de sinalização guiados por quinases, o FRK é frequentemente estudado para definir como a fosforilação em tirosina remodela programas transcricionais e o estado fenotípico.

Rak O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FRK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rak O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FRK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FRK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rak. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FRK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rak no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rak em células tumorais com expressão de FRK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.