RAG-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401821-ACT

RAG1 codifica a RAG-1, uma endonuclease específica de células linfoides essencial para iniciar a recombinação V(D)J durante o desenvolvimento de linfócitos B e T, ao introduzir quebras de dupla fita no DNA, sítio-específicas, em sequências sinalizadoras de recombinação. Essa atividade conecta a diversificação dos receptores de antígeno às vias de resposta a dano no DNA e de reparo, particularmente a junção de extremidades não homólogas, para assegurar a montagem produtiva dos loci de imunoglobulinas e do receptor de células T. A desregulação ou o comprometimento da função da RAG-1 está associado a maturação defeituosa de linfócitos e instabilidade genômica, vinculando a biologia de RAG1 a fenótipos de imunodeficiência primária e a rearranjos cromossômicos aberrantes. Como guardiã da formação do repertório imune adaptativo, a RAG-1 é amplamente estudada em mecanismos de clivagem programada do DNA, acessibilidade da cromatina e diferenciação de células imunes.

RAG-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAG1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RAG-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAG1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAG1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RAG-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAG1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RAG-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RAG-1 em células tumorais com expressão de RAG1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.