Raftlin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406009-ACT

RFTN1 kodiert Raftlin, ein mit Lipid-Rafts assoziiertes Scaffold-Protein, das in Immunzellen angereichert ist und dort zur Organisation von Membran-Mikrodomänen beiträgt, die rezeptornahe Signalprozesse koordinieren. Raftlin unterstützt Signalwege des B‑Zell‑Rezeptors und anderer Immunrezeptoren, indem es die Lokalisation und Stabilität von Signalkomplexen in cholesterinreichen Rafts reguliert und dadurch nachgeschaltete, mit MAPK und NF‑κB verknüpfte Transkriptionsprogramme beeinflusst. Entsprechend wird RFTN1 im Kontext von Immunaktivierung, der Dynamik der Antigenrezeptor-Signalübertragung und der Regulation inflammatorischer Netzwerke untersucht; berichtet wurden zudem Zusammenhänge mit Phänotypen immunvermittelter Erkrankungen und veränderter Funktion von Immunzellen. Aufgrund seiner membrannahen Positionierung ist es ein hilfreicher Knotenpunkt, um zu analysieren, wie die Organisation von Rafts die Signaltransduktion und zelluläre Antworten prägt.

Raftlin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RFTN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Raftlin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RFTN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RFTN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Raftlin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RFTN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Raftlin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Raftlin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RFTN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.