Rad1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403600-ACT

O RAD1 humano codifica a proteína Rad1, um componente central da pinça de checkpoint RAD9A–HUS1–RAD1 (9-1-1), que é carregada em DNA danificado para coordenar a vigilância do genoma. A Rad1 sustenta a sinalização mediada por ATR, promove a estabilidade da forquilha de replicação e interage com vias de reparo de DNA, incluindo o reparo por excisão de base e o reparo por excisão de nucleotídeos, para manter a integridade cromossômica. Por meio dessas funções, o RAD1 influencia o controle de checkpoints do ciclo celular, as respostas ao estresse replicativo e a resolução de lesões no DNA que, de outra forma, levariam à instabilidade genômica. A desregulação da capacidade de checkpoint e reparo envolvendo o complexo 9-1-1 tem sido associada a fenótipos de dano ao DNA relacionados ao câncer e à sensibilidade ao estresse genotóxico em modelos experimentais.

Rad1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rad1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rad1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rad1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rad1 em células tumorais com expressão de RAD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.