PU.1/Spi1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400547-ACT

SPI1 codifica PU.1 (Spi1), un fattore di trascrizione della famiglia ETS che agisce come regolatore determinante della linea nella differenziazione ematopoietica, in particolare nei compartimenti mieloide e delle cellule B. PU.1 si lega a motivi ETS conservati per coordinare programmi trascrizionali che controllano l’impegno dei progenitori, la presentazione dell’antigene, i componenti della segnalazione delle immunoglobuline e i geni effettrici dell’immunità innata, integrando segnali provenienti da vie di citochine e fattori di crescita. Alterazioni del dosaggio di SPI1 o dell’architettura della sua rete regolatoria perturbano l’omeostasi ematopoietica e sono implicate nella leucemogenesi e nella disregolazione immunitaria attraverso effetti a valle su differenziazione, proliferazione ed espressione di geni infiammatori. In quanto nodo centrale nei circuiti di regolazione genica ematopoietici, PU.1 è ampiamente utilizzato per modellare decisioni di destino cellulare guidate da fattori di trascrizione e per mappare la connettività enhancer-promoter nelle cellule immunitarie.

PU.1/Spi1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPI1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PU.1/Spi1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPI1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPI1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PU.1/Spi1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPI1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PU.1/Spi1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PU.1/Spi1 nelle cellule tumorali con espressione di SPI1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.