PP2A-B56-β Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403233-ACT

O PPP2R5B codifica a subunidade regulatória B56β da PP2A, um membro da família B56 que direciona a montagem do holoenzima proteína fosfatase 2A e a especificidade por substratos. Ao direcionar a PP2A para complexos definidos, a PP2A-B56β contribui para o controlo dinâmico da sinalização dependente de fosforilação, incluindo a progressão do ciclo celular, as respostas a danos no DNA e a regulação do checkpoint mitótico. A desfosforilação orientada pela PP2A-B56β também interseta nós das vias PI3K/AKT e MAPK por meio da regulação de substratos quinase e de proteínas de andaime, moldando programas de proliferação e adaptação ao stress. A expressão ou função desregulada da PP2A-B56β tem sido associada a sinalização aberrante e fenótipos de instabilidade genómica frequentemente estudados na biologia do cancro e noutras perturbações proliferativas.

PP2A-B56-β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP2R5B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PP2A-B56-β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP2R5B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP2R5B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PP2A-B56-β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP2R5B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PP2A-B56-β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PP2A-B56-β em células tumorais com expressão de PPP2R5B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.