Plásmido CRISPR de Activación (h) Pontin 52: sc-402304-ACT

El gen humano RUVBL1 codifica Pontin 52, una ATPasa AAA+ que funciona en ensamblajes multiproteicos que regulan la arquitectura de la cromatina, el control transcripcional y la biogénesis de complejos macromoleculares. Pontin 52 es un componente central del complejo cocochaperón R2TP y favorece la maduración dependiente de HSP90 de varios complejos cliente, lo que lo vincula a procesos como las respuestas al daño del ADN, la remodelación de la cromatina y el ensamblaje de ribonucleoproteínas. A través de interacciones con reguladores transcripcionales y factores de remodelación, RUVBL1 influye en la progresión del ciclo celular y en programas de expresión génica adaptativos al estrés. La actividad desregulada de RUVBL1/Pontin 52 y la expresión alterada se han asociado con señalización proliferativa y defectos en el mantenimiento del genoma, lo que lo convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos en vías relevantes para el cáncer y redes de proteostasis.

Pontin 52 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RUVBL1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Pontin 52 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RUVBL1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RUVBL1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Pontin 52. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RUVBL1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Pontin 52 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Pontin 52 en células tumorales con expresión de RUVBL1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.