PON1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402701-ACT

Humanes PON1 (Paraoxonase 1) ist eine calciumabhängige Esterase/Lactonase, die im Plasma überwiegend an HDL gebunden ist und dort zur Entgiftung von Organophosphaten sowie zur Hydrolyse oxidierter Lipide beiträgt. Indem PON1 Lipidperoxidationsprodukte begrenzt und bioaktive Lactone modifiziert, greift es in Reaktionen auf oxidativen Stress, den Umbau von Lipoproteinen und inflammatorische Signalwege ein, die mit der vaskulären Homöostase verbunden sind. Unterschiede in PON1-Expression und enzymatischer Aktivität werden mit kardiometabolischem Risiko, atherosklerotischen Prozessen und der Anfälligkeit gegenüber Xenobiotika-Exposition in Zusammenhang gebracht und häufig zusammen mit anderen antioxidativen und lipidverarbeitenden Signalwegen untersucht. Diese Eigenschaften machen PON1 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur HDL-Funktion, Redoxbiologie und Gen–Umwelt-Interaktionen in humanen Zellmodellen.

PON1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PON1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PON1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PON1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PON1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PON1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PON1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PON1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PON1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PON1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.