PNUTS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403688-ACT

PPP1R10 codifica a PNUTS (subunidade reguladora 10 da proteína fosfatase 1), uma subunidade de direcionamento nuclear que se liga à PP1 e modula a atividade fosfatásica em substratos associados à cromatina. A PNUTS participa do controle transcricional, da sinalização da resposta a danos no DNA e da progressão do ciclo celular ao coordenar a desfosforilação de proteínas com vias de manutenção do genoma. Ela tem sido relacionada à regulação da transcrição dependente da RNA polimerase II e a processos que afetam a estabilidade dos telômeros e o estresse replicativo. Alterações na atividade de PPP1R10/PNUTS têm sido associadas à proliferação desregulada e a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia do câncer e outros distúrbios que envolvem reparo de DNA prejudicado e sinalização nuclear alterada.

PNUTS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP1R10 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PNUTS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP1R10 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP1R10, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PNUTS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP1R10 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PNUTS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PNUTS em células tumorais com expressão de PPP1R10 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.