PLC β1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401141-ACT

Il gene umano **PLCB1** codifica la fosfolipasi C β1 (PLCβ1), un effettore chiave a valle dei recettori accoppiati a proteine G, che collega la segnalazione di Gαq/11 al turnover dei fosfoinositidi. Una volta attivata, PLCβ1 idrolizza il PIP2 generando IP3 e diacilglicerolo, innescando il rilascio intracellulare di Ca2+ e l’attivazione di PKC, che influenzano secrezione, eccitabilità e programmi trascrizionali. Questo asse di segnalazione si integra con le vie MAPK e calcio-dipendenti per modellare le risposte di neuroni e cellule immunitarie, e un’alterata attività di PLCB1 è stata associata a fenotipi neuropsichiatrici e neurologici, oltre che a una deregolazione della segnalazione cellulare in contesti rilevanti per la malattia. Lo studio della regolazione di PLCB1 aiuta a chiarire come le dinamiche dei secondi messaggeri guidate dai recettori controllino l’espressione genica a valle e lo stato cellulare.

PLC β1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PLCB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PLC β1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PLCB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PLCB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PLC β1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PLCB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PLC β1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PLC β1 nelle cellule tumorali con espressione di PLCB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.