Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKC nu: sc-403822-ACT

PRKD3 code la protéine kinase D3 (PKC nu), une kinase sérine/thréonine qui agit en aval de la signalisation des PKC dépendantes du diacylglycérol afin de réguler des réseaux de phosphorylation contrôlant la prolifération, la survie et la migration cellulaires, ainsi que le trafic vésiculaire. PKC nu participe à l’intégration des signaux provenant des GPCR et des récepteurs à activité tyrosine kinase, et contribue aux réponses transcriptionnelles liées aux voies MAPK/ERK et NF-κB, avec des rôles supplémentaires dans le remodelage du cytosquelette et le transport du Golgi vers la membrane plasmique. Une activité altérée de PRKD3 a été associée à une dérégulation de la signalisation des facteurs de croissance et à des phénotypes invasifs dans plusieurs contextes cancéreux, ce qui en fait un nœud utile pour étudier le remaniement des voies oncogéniques. Dans des modèles cellulaires humains, la perturbation de PRKD3 est couramment utilisée pour étudier le contrôle, par les kinases, des réponses au stress, des programmes de motilité et de la régulation transcriptionnelle.

PKC nu Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC nu Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC nu. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC nu au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC nu dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.