PHF5A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407986-ACT

PHF5A (proteina 5A con dito PHD) è un componente conservato della sottocomplesso SF3b dello snRNP U2 e supporta l’assemblaggio dello spliceosoma e la fedeltà dello splicing del pre-mRNA. Stabilizzando il riconoscimento del punto di ramificazione e del sito di splicing 3′, PHF5A contribuisce alla selezione delle isoforme trascrittomiche, influenzando la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e i programmi di differenziamento. La perturbazione dello splicing dipendente da PHF5A può rimodellare le reti di espressione genica ed è stata associata a vulnerabilità in contesti di elaborazione dell’RNA deregolata, inclusi stati oncogenici in cui la funzione dello spliceosoma è sotto stress. In quanto fattore di splicing centrale, PHF5A è spesso utilizzato per studiare le vie di maturazione dell’RNA e i meccanismi guidati dallo splicing alla base dei cambiamenti fenotipici.

PHF5A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PHF5A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PHF5A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PHF5A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PHF5A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PHF5A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PHF5A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PHF5A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PHF5A nelle cellule tumorali con espressione di PHF5A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.