PGDH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402622-ACT

O HPGD humano codifica a 15-hidroxiprostaglandina desidrogenase (PGDH), a enzima limitante da velocidade responsável pela oxidação dependente de NAD+ e pela inativação de prostaglandinas bioativas, como a PGE2. Ao controlar o turnover de prostanoides, a PGDH modula as saídas de sinalização de prostaglandinas/COX que influenciam a inflamação, a homeostase epitelial, sinais angiogênicos e o remodelamento tecidual. Alterações na atividade de HPGD deslocam o equilíbrio local de eicosanoides e são frequentemente estudadas em contextos nos quais a desregulação do metabolismo de prostaglandinas contribui para sinalização imune aberrante e fenótipos proliferativos. Como guardião do catabolismo de prostaglandinas, o HPGD é um nó útil para dissecar a comunicação cruzada entre mediadores inflamatórios, estado metabólico e programas transcricionais.

PGDH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HPGD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PGDH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HPGD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HPGD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PGDH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HPGD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PGDH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PGDH em células tumorais com expressão de HPGD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.