PDZ-RhoGEF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403444-ACT

ARHGEF11 codifica a PDZ-RhoGEF, um fator de troca de nucleótidos de guanina específico para RhoA que acopla a sinalização ativada de Gα12/13 à ativação de RhoA e à remodelação subsequente do citoesqueleto. Ao promover a atividade da via RhoA–ROCK, a PDZ-RhoGEF regula a formação de fibras de stress de actina, a dinâmica das adesões focais, a polaridade celular e a contractilidade, influenciando processos como a migração celular e a organização das junções. A sinalização associada a ARHGEF11 cruza-se com redes de GPCR e vias de mecanotransdução que moldam a arquitetura dos tecidos e as respostas inflamatórias. A desregulação da sinalização de Rho GTPases envolvendo a PDZ-RhoGEF tem sido associada a alterações de motilidade e invasividade na biologia do cancro, bem como a fenótipos vasculares e metabólicos em estudos genéticos e funcionais.

PDZ-RhoGEF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ARHGEF11 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDZ-RhoGEF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ARHGEF11 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ARHGEF11, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDZ-RhoGEF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ARHGEF11 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDZ-RhoGEF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDZ-RhoGEF em células tumorais com expressão de ARHGEF11 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.