PDK4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401355-ACT

O PDK4 humano codifica a quinase 4 da piruvato desidrogenase, uma quinase mitocondrial que fosforila e inibe o complexo piruvato desidrogenase para limitar a entrada de piruvato no ciclo do TCA e promover uma mudança metabólica em direção à oxidação de ácidos graxos. Sua expressão é regulada dinamicamente por jejum, glicocorticoides e sinalização por PPAR, integrando o sensoriamento de nutrientes com a bioenergética mitocondrial e o equilíbrio redox celular. Ao modular o fluxo glicolítico versus o metabolismo oxidativo, o PDK4 influencia a responsividade à insulina e o manejo de lipídios em tecidos metabolicamente ativos. A atividade desregulada de PDK4 e o controle transcricional alterado têm sido associados a fenótipos de estresse metabólico e são frequentemente estudados em contextos como resistência à insulina, esteatose e reprogramação metabólica alterada de células tumorais.

PDK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDK4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDK4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDK4 em células tumorais com expressão de PDK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.