PCNA CRISPR Activationプラスミド (h2): sc-400037-ACT-2

ヒトPCNA（proliferating cell nuclear antigen）は、同一サブユニット3量体からなるDNAスライディングクランプであり、DNAポリメラーゼや多数の修復因子・クロマチン修飾因子のための中心的な足場として機能し、S期における高いプロセシビティを伴うDNA合成を協調的に進める。PCNAは、ミスマッチ修復、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、トランスリージョン合成などを含むDNA損傷耐性・修復経路と複製を統合し、ユビキチン化やSUMO化といった翻訳後修飾によって相互作用パートナーの選択に影響を与えることでその活性が調節される。PCNAの発現や相互作用ネットワークの破綻は、がんやその他の複製ストレス関連病態でみられるゲノム不安定性や異常増殖としばしば関連する。PCNAは、生物医学研究において細胞周期進行のマーカーとして広く用いられるとともに、ヒト細胞におけるレプリソームの構築、複製フォーク動態、修復経路選択を機構的に解析するための重要な切り口となっている。

PCNA CRISPR活性化プラスミド（h2）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PCNAの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PCNA CRISPR 活性化プラスミド (h2) は、ヒト細胞株における PCNA 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPCNA転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PCNAの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPCNA遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPCNA依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPCNA発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPCNA経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。