PARD6B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401699-ACT

Il gene umano PARD6B codifica Par-6 beta, una proteina scaffold di polarità contenente un dominio PDZ che assembla il complesso di polarità PAR con PAR3 e PKC atipica per stabilire la polarità apico-basolaterale e coordinare la formazione delle giunzioni serrate. Attraverso interazioni con piccole GTPasi come CDC42 e RAC1, PARD6B contribuisce a regolare la dinamica del citoscheletro, la divisione cellulare orientata e la morfogenesi epiteliale, con effetti a valle su migrazione e architettura tissutale. Un’alterazione della segnalazione di polarità che coinvolge PARD6B è stata associata a disorganizzazione epiteliale e fenotipi invasivi in contesti rilevanti per il cancro; inoltre, PARD6B è studiato anche nei processi di sviluppo e nella funzione di barriera. In quanto hub di segnalazione a livello delle giunzioni cellula–cellula, PARD6B rappresenta un punto di accesso pratico per analizzare programmi trascrizionali e fenotipici dipendenti dalla polarità.

PARD6B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARD6B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PARD6B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARD6B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARD6B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PARD6B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARD6B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PARD6B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PARD6B nelle cellule tumorali con espressione di PARD6B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.