p8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402153-ACT

Human NUPR1 kodiert das stressinduzierbare, chromatinassoziierte Protein p8 – einen kleinen, intrinsisch ungeordneten Regulator von Transkriptionsprogrammen, die die Anpassung an zelluläre Schädigung koordinieren. p8 integriert Signale aus ER-Stress, oxidativem Stress und Nährstoffmangel und beeinflusst dadurch die Zellzykluskontrolle, Apoptose, Autophagie und DNA-Schadensantworten, indem es abhängig vom Kontext Transkriptionsfaktor-Netzwerke moduliert. Es wurde mit dem Umbau entzündlicher und metabolischer Signalwege sowie mit Veränderungen epithelial-mesenchymaler Eigenschaften in Verbindung gebracht, was seine Rolle in der zellulären Plastizität stützt. Eine fehlregulierte NUPR1/p8-Aktivität wird häufig in der Onkologie und in der entzündungsassoziierten Pathobiologie untersucht, wo eine veränderte Stresstoleranz und pro-survivale Signalgebung zu krankheitsrelevanten Phänotypen beitragen.

p8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NUPR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NUPR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NUPR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NUPR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NUPR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.