p8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402153-ACT

O NUPR1 humano codifica a proteína p8, associada à cromatina e induzível por estresse, um pequeno regulador intrinsecamente desordenado de programas transcricionais que coordenam a adaptação à lesão celular. A p8 integra sinais de estresse do retículo endoplasmático (RE), estresse oxidativo e limitação de nutrientes para influenciar o controle do ciclo celular, a apoptose, a autofagia e as respostas a danos no DNA por meio da modulação dependente do contexto de redes de fatores de transcrição. Ela tem sido associada ao remodelamento de vias inflamatórias e metabólicas e a alterações em características epitelial–mesenquimais, sustentando papéis na plasticidade celular. A atividade desregulada de NUPR1/p8 é frequentemente estudada em oncologia e na patobiologia associada à inflamação, nas quais a tolerância alterada ao estresse e a sinalização de sobrevivência contribuem para fenótipos relevantes para a doença.

p8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NUPR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NUPR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NUPR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NUPR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p8 em células tumorais com expressão de NUPR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.