P504S Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403603-ACT

O AMACR humano codifica a racemase alfa-metilacil-CoA (P504S), uma enzima peroxissomal e mitocondrial que interconverte tioésteres de acil-CoA com ramificação 2-metil nas configurações (R) e (S), permitindo a β-oxidação subsequente. Essa atividade sustenta o catabolismo de ácidos graxos de cadeia ramificada e de intermediários de ácidos biliares, vinculando o AMACR à homeostase do metabolismo lipídico e à comunicação peroxissomo–mitocôndria. A expressão desregulada de AMACR e programas alterados de oxidação de ácidos graxos têm sido associados à remodelação metabólica ligada a tumores, tornando o AMACR um marcador molecular amplamente utilizado na biologia do câncer. Assim, o AMACR é relevante para o estudo de dependências de vias metabólicas, equilíbrio redox e sinalização derivada de lipídios em células humanas.

P504S O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AMACR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

P504S O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AMACR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AMACR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de P504S. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AMACR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de P504S no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via P504S em células tumorais com expressão de AMACR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.