Plásmido CRISPR de Activación (h) P2X1: sc-404030-ACT

El P2RX1 humano codifica el canal catiónico regulado por ATP P2X1, un receptor purinérgico trimérico que se abre rápidamente en respuesta al ATP extracelular para mediar la entrada de Na+ y Ca2+ y la despolarización de la membrana. La señalización de P2X1 contribuye a la neurotransmisión purinérgica, la activación plaquetaria, la quimiotaxis de leucocitos y la contracción del músculo liso, vinculando la liberación de nucleótidos extracelulares con vías intracelulares dependientes de calcio. A través de la regulación de la dinámica del calcio y de la excitabilidad, P2X1 influye en el tono vascular, las respuestas tromboinflamatorias y los programas de activación de células inmunitarias. La actividad alterada de P2RX1/P2X1 se ha investigado en contextos que incluyen la función plaquetaria y la biología de la trombosis, la señalización inflamatoria y la fisiología del tracto reproductor, lo que lo convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos de las vías purinérgicas.

P2X1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de P2RX1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

P2X1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus P2RX1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional P2RX1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de P2X1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo P2RX1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de P2X1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía P2X1 en células tumorales con expresión de P2RX1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.