NUAK1/ARK5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403053-ACT

NUAK1 (também conhecido como ARK5) codifica uma quinase de serina/treonina da família de quinases relacionadas à AMPK, que integra sinais de energia e de estresse a programas celulares de sobrevivência. NUAK1/ARK5 participa de redes de sinalização a jusante de LKB1 e se cruza com vias que controlam metabolismo, dinâmica do citoesqueleto, adesão e progressão do ciclo celular, incluindo a modulação da sinalização MYPT1/PP1 e da contratilidade actomiosina. Por meio dessas funções, NUAK1 tem sido implicado na regulação de proliferação, migração e tolerância ao estresse em múltiplos tipos celulares. A atividade e a expressão desreguladas de NUAK1 têm sido associadas à biologia tumoral e a outros contextos em que a adaptação metabólica e o comportamento invasivo estão sob investigação.

NUAK1/ARK5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NUAK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NUAK1/ARK5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NUAK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NUAK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NUAK1/ARK5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NUAK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NUAK1/ARK5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NUAK1/ARK5 em células tumorais com expressão de NUAK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.