NT-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402291-ACT

O NTF4 humano codifica a neurotrofina-4 (NT-4), um fator de crescimento secretado que sinaliza principalmente por meio de NTRK2/TrkB e, com menor afinidade, por NGFR/p75NTR, regulando a sobrevivência neuronal, a diferenciação e a manutenção sináptica. A interação NT-4–TrkB ativa as vias de sinalização a jusante PI3K–AKT, MAPK/ERK e PLCγ, sustentando o crescimento de neuritos e a plasticidade dependente de atividade nos sistemas nervosos central e periférico. Para além da neurobiologia, a expressão de NTF4 e a atividade da via de TrkB influenciam respostas ao estresse celular e programas de suporte trófico que se cruzam com degeneração e remodelamento mal-adaptativo. A desregulação da sinalização de neurotrofinas/TrkB tem sido estudada em contextos que incluem processos neurodegenerativos, mecanismos de dor neuropática e interações entre células tumorais e o microambiente, nas quais a disponibilidade de fatores de crescimento pode moldar fenótipos de proliferação e sobrevivência.

NT-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NTF4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NT-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NTF4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NTF4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NT-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NTF4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NT-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NT-4 em células tumorais com expressão de NTF4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.