NPT2b Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403580-ACT

SLC34A2 codifica o transportador de fosfato dependente de sódio NPT2b (NaPi-IIb), uma proteína de membrana multipasso que medeia a captação de fosfato inorgânico através de superfícies epiteliais. O NPT2b sustenta a homeostase do fosfato necessária para a síntese de nucleótidos, o metabolismo de fosfolípidos e a sinalização dependente de energia, ligando a atividade do transportador a programas metabólicos e de diferenciação mais amplos. Em tecidos humanos, a expressão de SLC34A2 é proeminente no pulmão e noutros epitélios, onde o manuseamento regulado do fosfato influencia a fisiologia alveolar e das mucosas. Alterações na função ou na expressão de SLC34A2 têm sido associadas a disfunção epitelial e a patobiologia relacionada com o fosfato, tornando-o um ponto de interesse útil para estudar o transporte de membrana, a deteção de nutrientes e a remodelação epitelial.

NPT2b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC34A2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NPT2b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC34A2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC34A2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NPT2b. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC34A2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NPT2b no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NPT2b em células tumorais com expressão de SLC34A2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.