Nopp140 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402907-ACT

NOLC1 codifica Nopp140, una fosfoproteina del nucleolo e dei corpi di Cajal che funge da impalcatura per l’assemblaggio di ribonucleoproteine e il traffico intranucleare. Nopp140 partecipa alla biogenesi dei ribosomi coordinando la dinamica degli snoRNP, la maturazione del pre-rRNA e l’organizzazione del nucleolo, e supporta la maturazione degli snRNP dello spliceosoma tramite interazioni con i corpi di Cajal. La sua attività è regolata da un’ampia fosforilazione ed è collegata a programmi trascrizionali dipendenti dalla RNA polimerasi I, alle risposte allo stress nucleolare e al controllo della crescita accoppiato al ciclo cellulare. La disregolazione dell’omeostasi nucleolare e delle vie di processamento dell’RNA che coinvolgono NOLC1/Nopp140 è rilevante per studi sulla segnalazione proliferativa, la stabilità del genoma e il rimodellamento dell’espressione genica adattativo allo stress nelle cellule umane.

Nopp140 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NOLC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nopp140 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NOLC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NOLC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nopp140. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NOLC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nopp140 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nopp140 nelle cellule tumorali con espressione di NOLC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.