Plasmide CRISPR d'Activation (h) NNT: sc-402908-ACT

La NNT (nicotinamide nucléotide transhydrogénase) humaine est une enzyme de la membrane interne mitochondriale qui couple la force proton-motrice au transfert d’équivalents réducteurs entre NAD(H) et NADP(H), maintenant les réserves mitochondriales de NADPH. En soutenant les systèmes antioxydants dépendants du glutathion et de la thiorédoxine, la NNT contribue à contrôler les espèces réactives de l’oxygène et à préserver l’homéostasie redox pendant la phosphorylation oxydative et en situation de stress métabolique. L’activité de la NNT influence la respiration mitochondriale, la stéroïdogenèse et une signalisation métabolique plus large via son impact sur les voies biosynthétiques et de détoxification dépendantes du NADPH. Une altération de la fonction de la NNT a été associée à un déséquilibre redox mitochondrial et a été étudiée dans des contextes incluant le dysfonctionnement métabolique et des troubles liés à une capacité réduite de tamponnement du stress oxydatif.

NNT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NNT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NNT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NNT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NNT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NNT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NNT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NNT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NNT dans les cellules tumorales présentant une expression de NNT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.