NNMT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403192-ACT

A NNMT humana (nicotinamida N-metiltransferase) é uma metiltransferase citosólica que catalisa a N-metilação da nicotinamida e de piridinas relacionadas usando S-adenosil-L-metionina, conectando o metabolismo de xenobióticos à homeostase de doadores de metila. Ao influenciar o equilíbrio SAM/SAH e o fluxo metabólico relacionado à nicotinamida/NAD⁺, a NNMT pode modular a capacidade de metilação epigenética e o estado metabólico mais amplo. A alteração da expressão de NNMT tem sido associada à reprogramação metabólica e a mudanças na diferenciação celular e nas respostas ao estresse em múltiplos contextos de doença, tornando-a um ponto útil para estudar o acoplamento metabolismo–epigenoma. Por isso, a NNMT é frequentemente investigada em vias relacionadas ao metabolismo de um carbono, à regulação redox e ao controle transcricional.

NNMT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NNMT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NNMT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NNMT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NNMT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NNMT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NNMT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NNMT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NNMT em células tumorais com expressão de NNMT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.