nm23-H7 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403079-ACT

O NME7 humano codifica a nm23-H7, um membro da família das quinases de nucleósidos difosfato (NDPK/NME), implicada na regulação da homeostase de nucleotídeos e em respostas de sinalização que dependem de pools equilibrados de NTP. A nm23-H7 tem sido associada a processos relacionados com o centrossoma e com os microtúbulos, apoiando a progressão do ciclo celular, o transporte intracelular e a organização da arquitetura do citoesqueleto. Alterações na atividade da família NME foram observadas em múltiplos contextos de doença, tornando o NME7 um nó útil para estudar como perturbações no metabolismo de nucleotídeos se intersectam com a sinalização proliferativa e a manutenção do genoma. Como resultado, o NME7 é frequentemente analisado em modelos de crescimento celular aberrante, instabilidade cromossómica e programas transcricionais adaptativos ao stress.

nm23-H7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NME7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

nm23-H7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NME7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NME7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de nm23-H7. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NME7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de nm23-H7 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via nm23-H7 em células tumorais com expressão de NME7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.