Nkx-2.3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406709-ACT

NKX2-3 codifica o fator de transcrição homeobox Nkx-2.3, um regulador de ligação ao DNA específico de sequência que ajuda a estabelecer e manter programas de identidade regional durante o desenvolvimento e também em tecidos adultos. Ele influencia redes transcricionais que controlam a diferenciação epitelial e mesenquimal, o padrão de organização dos tecidos e decisões de destino celular, com efeitos a jusante sobre a expressão gênica restrita a linhagens e sobre a sinalização do microambiente. Alterações na atividade de NKX2-3 têm sido associadas a desregulação da homeostase imune da mucosa e da biologia intestinal, sustentando sua relevância em estudos de regulação gênica ligada à inflamação e de circuitos transcricionais associados a doenças. Como um fator nuclear que atua em elementos promotores e potenciadores (enhancers), Nkx-2.3 é um ponto útil para dissecar mecanismos de controle transcricional dependentes do contexto.

Nkx-2.3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NKX2-3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Nkx-2.3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NKX2-3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NKX2-3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Nkx-2.3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NKX2-3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Nkx-2.3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Nkx-2.3 em células tumorais com expressão de NKX2-3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.