nicastrin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402790-ACT

O NCSTN humano codifica a nicastrina, uma glicoproteína transmembranar do tipo I que atua como uma subunidade essencial do complexo γ-secretase, auxiliando no reconhecimento de substratos e na maturação de complexos proteolíticos que contêm presenilina. Por meio da atividade da γ-secretase, a nicastrina contribui para a proteólise intramembranar regulada de diversos substratos, incluindo receptores NOTCH e a proteína precursora do amiloide, ligando o NCSTN à sinalização de Notch, a decisões de destino celular e ao turnover de proteínas de membrana. A perturbação de componentes da γ-secretase pode alterar programas de diferenciação, sinalização inflamatória e proteostase, tornando o NCSTN um ponto amplamente estudado em vias relevantes para a neurobiologia, a homeostase epitelial e a biologia da pele. A desregulação do NCSTN e suas variantes têm sido associadas a distúrbios que envolvem atividade aberrante da via Notch e respostas epidérmicas ou imunes alteradas, oferecendo contexto mecanístico para estudos de genômica funcional.

nicastrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NCSTN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

nicastrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NCSTN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NCSTN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de nicastrin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NCSTN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de nicastrin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via nicastrin em células tumorais com expressão de NCSTN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.