NGAL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401838-ACT

LCN2 kodiert das neutrophile Gelatinase-assoziierte Lipocalin (NGAL), ein sezerniertes Lipocalin, das Siderophor-Eisen-Komplexe bindet und den Eisenverkehr sowie die antimikrobielle Abwehr und Stressantworten von Epithelzellen moduliert. NGAL ist an der angeborenen Immunsignalgebung und an Entzündungsprogrammen beteiligt, einschließlich der Wechselwirkungen mit NF-κB- und zytokingesteuerten Signalwegen, und wird häufig durch Gewebeschäden und zellulären Stress induziert. In der Humanbiologie wurde eine veränderte LCN2/NGAL-Expression mit fehlregulierter Entzündung, metabolischer Umprogrammierung und Veränderungen der tumorassoziierten Mikroumgebung in Verbindung gebracht, was NGAL zu einem nützlichen Marker und mechanistischen Knotenpunkt für die Untersuchung von Immun–Epithel-Interaktionen macht. Seine Funktionen in der Dynamik der extrazellulären Matrix und in proteaseassoziierten Prozessen verknüpfen NGAL zudem mit Kontexten wie Barrierefunktionsstörungen und Remodeling-Phänotypen.

NGAL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LCN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NGAL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LCN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LCN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NGAL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LCN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NGAL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NGAL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LCN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.